慢性束縛致學習記憶障礙模型

文獻中關于建立該模型所使用的大小鼠品系繁多。慢性束縛應激動物模型都采用常用的模式動物, 如大鼠和小鼠。多選用封閉群 Sprague- Dawley 、 Wistar大鼠 , 也有Lister和Fische大鼠;CD-1 、C3H 、BALAc、 LACA 小鼠。在不同生長階段的研究中又包括幼鼠 、孕鼠 、成熟鼠和老齡鼠 。 本實驗室一般選用8-10周齡左右的Wistar 大鼠、5-10周齡的SD大鼠和4-6周齡的ICR小鼠、10 ～ 12 周齡的C57BL /6J小鼠。雄性多見。

1、實驗儀器

束縛采用的實驗儀器為大、小鼠行為限制器。由聚酯材料構成，透明可視，方便監視大小鼠的行為狀態。頂端和底部有多個直徑1cm通氣孔，有助于大小鼠的呼吸暢通、排泄物的排出，避免對建模帶來干擾。行為限制器的長度可調，可將不同體重動物的束縛強度同一化。

圖1 行為限制器實物圖

2.實驗方法

將行為限制器平放、底部敞開，使動物面朝行為限制器敞口進入內部。用配套的塞托封閉開口并固定塞托。使固定后，動物在行為限制器內的空間長度小于其身長，并保證只有頭部可以自由活動而四肢活動受限（圖2）。

圖2 行為限制器的大鼠束縛

慢性束縛模型是采用行為制動的方式對動物產生單純性心理應激，是比較常用的用于制備情緒、學習記憶障礙等動物模型的方法。引起抑郁、焦慮和學習記憶障礙的束縛強度不同文獻報導有一定的差異。大多報導強度在4 h-8 h/day、連續14-48 d 。

慢性束縛致學習記憶模型的建立

一般慢性束縛致大鼠學習記憶障礙模型的建立采用每日限制大鼠活動 10 h( 18: 00 至次日 8: 00) ，限制活動期間各組禁食禁水。連續限制活動 28 d，第 29 天開始進行行為學測試。

一般慢性束縛致小鼠學習記憶障礙模型的建立采用每日限制大鼠活動 6h（10：00-16：00），限制活動期間各組禁食禁水。連續限制活動 21 d，第 22 天開始進行行為學測試。

3、行為學檢測

慢性束縛到規定時間后，依實驗需要，采用學習記憶行為實驗方法進行檢測。

4. 注意事項

（1）行為實驗檢測應在動物自由飲食飲水期間進行。

（2）實驗動物大鼠體重應該控制在 280-300 g。小鼠體重應該控制在25-32 g

（3）由于束縛器是樹脂材料的圓柱形，頂端有數個通氣的小孔，才束縛早期由于動物掙扎劇烈，會出現動物窒息的情況，所以一開始需要我們 24 h 觀察，及時排除動物窒息死亡的情形。

（4）行為測試完畢后的動物要返回行為限制器內至實驗結束。

5. 模型分析指標

5.1 水迷宮實驗

圓形迷宮直徑為159 cm、高50 cm，池中水深25. 5 cm 左右，內置平臺直徑9 cm、高24 cm，水溫維持在( 24 ± 1) ℃。將迷宮置于空間信息相對豐富的實驗環境中，作為動物學習過程中的空間參照物，整個試驗周期內保持環境信息固定不變。將迷宮均分為4 個象限，將平臺置于其中一個象限中央，作為實驗中動物逃離水環境的唯一途徑，空間記憶階段保持平臺位置固定不變。選擇其余3 個象限作為動物的入水點將動物面向池壁放入水中，每天訓練3 次，每次變換入水點位置( 使動物可分別從3 個象限入水) ，且每天所有動物入水點的順序保持一致。每次訓練前適應10 s，使動物獲取并學習空間環境信息。設置檢測時間為60s 后，將動物放入水中，若動物在60 s 內找到平臺，算作尋臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留休息10 s。若動物在60 s內未找到平臺，結束此次訓練并記錄潛伏期為60 s，并引導動物靠近平臺使其在平臺上停留10 s。每只動物訓練的時間間隔為40 min。每天每只動物3 次訓練學習的潛伏期平均值，作為評價動物這一天學習能力的指標。經過5d 的訓練學習后，第6 天撤去平臺，進行空間探索實驗。將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，檢測其在60s 內在原平臺象限的游程比、時間比，以及穿過原平臺所在位置的次數，作為評價空間記憶能力的指標。

5.2 水迷宮工作記憶

空間探索實驗結束次日，開始工作記憶實驗。工作記憶歷時3d，分別將平臺置于其余3 個不同象限中，每天變換平臺位置，同一天內平臺位置保持不變。每天訓練3 次，依次從其余3 個非平臺象限將動物面朝池壁放入水中。訓練前不予適應，其余同空間訓練階段一致。計算3 天中，第2 次訓練潛伏期的平均值，作為評價動物學習記憶能力的指標。

5.3新物體識別實驗

實驗箱為黑色聚酯塑料材質構成的封閉箱，體積為60 cm × 40 cm × 80 cm，箱體左右兩側各有兩排LED 燈條照明，既避免了強光直射對動物行為的干擾，又可以作為計算機對動物行為識別的背景光。頂部采用攝像頭觀察動物的活動情況及探索過程。實驗過程分為3 個階段: 適應期、熟悉期、測試期。適應期為3d，每天將動物依次放入實驗箱內，熟悉環境10 min。適應期結束后，次日進行熟悉和測試。熟悉期時，將兩個完全相同的物體放入實驗箱內對稱的位置處，此兩物體距離側箱壁、箱后壁的距離均為10 cm。記錄大鼠5 min 內對兩物體的探索總時間。間隔30 min 后，進入測試期。測試期內，將其中一個熟悉物體換為另一個大小相近但形狀和顏色不同的新穎物體，記錄大鼠對新穎物體和熟悉物體的探索時間，用辨別指數( discriminationindex，DI) 來評價動物的學習記憶能力。辨別指數計算公式為DI = ( N-F) /( N + F) × 100%，其中N( new) 為新穎物體探索時間，F( familiar) 為熟悉物體探索時間。