包括實驗材料（實驗動物、試劑、儀器）、實驗環境、細胞培養/載體構建//蛋白表達/病原培養鑒定方法、實驗操作規程、動物處理倫理等內容。
3.1 實驗材料
3.1.1 實驗動物
SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.
3.1.2實驗儀器
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儀器及耗材
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生產廠商
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NanoZoomer S60數字病理切片掃描儀
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日本濱松光子學株式會社
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Vevo770小動物超聲影像系統
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VisualSonics
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激光共聚焦掃描顯微鏡
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Leica
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透射電子顯微鏡
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JEOL
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顯微注射儀
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Nikon
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光學顯微鏡
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Nikon
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化學發光凝膠成像系統
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BIO-RAD
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PCR儀
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BIO-RAD
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組織脫水機
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Leica
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石蠟切片機
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Leica
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石蠟包埋機
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Leica
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冰凍切片機
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Leica
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電泳儀
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BIO-RAD
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電泳槽
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Tanon
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數碼凝膠圖像處理系統
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Tanon
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組織勻漿機
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POLYTRON
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恒溫培養箱
溫控振蕩箱
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Incucell
TAITEC
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離心機
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Eppendorf
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搖床
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SCILOGEX
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塑料薄膜封口機
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德清拜杰有限公司
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電動鼓風干燥箱
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天津市泰斯特儀器有限公司
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電子稱量器（量程0.5g-620g）
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奧豪斯儀器（常州）有限公司
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電子稱量器（量程0.1mg-220g）
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Sartorius
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4℃冰箱
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海爾集團
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-80℃冰箱
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SANYO
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-20℃冰箱
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SANYO
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渦旋振蕩器
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上海滬西分析儀器廠
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移液器
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Eppendorf
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3.1.3實驗試劑
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試劑
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生產廠商
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體外轉錄用試劑盒
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Ambion
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Taq DNA聚合酶
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TaKaRa
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T7 轉錄試劑盒
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Invitrogen
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T4 DNA裂連接
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TaKaRa
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膠回收試劑盒
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Qiagen
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質粒提取試劑盒
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Axygen
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Trizol試劑
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Invitrogen
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逆轉錄試劑盒
DNA提取試劑盒
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Invitrogen
北京全式金生物科技有限公司
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Epha4（ab157588）抗體
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Abcam
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GADPH
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Santa Cruz Biotechnology
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NC膜
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Millipore
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化學發光液
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Immuno Cruz
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蛋白質分子量標記物
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Takara
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蛋白酶抑制劑
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羅氏
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組織裂解液
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Thermo
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麗春紅
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Beyotime
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BCA試劑盒
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Beyotime
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Western blot 洗液（10×）
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Beyotime
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30%Acr-Bis
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Beyotime
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SDS-PAGE電泳液
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Beyotime
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Western blot轉膜液（粉劑）
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Beyotime
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TEMED
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Beyotime
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過硫酸銨
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Beyotime
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1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）緩沖液
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Beyotime
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1 M Tris·HCl（pH=6.8）緩沖液
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Beyotime
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瓊脂
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BD公司
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異丙醇
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北京化工廠
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脫脂奶粉
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內蒙古伊利實業集團股份有限公司
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3.1.4模型構建流程
在Epha4基因的啟動子后插入一個報告基因mCherry，造成移碼突變，實現基因敲除，制備Epha4基因敲除大鼠，并使用PCR方法進行基因型鑒定，使用Western blot技術進行敲除效率的鑒定。
3.1.5 Epha4敲除大鼠的建立
3.1.5.1 Epha4敲除大鼠模型的建立
- 設計方案
圖 1. Epha4敲除模型構建設計方案
- 構建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據基因信息選擇靶點并合成sgRNA。
靶點1:
CCA GCCTCCGGAGACCTTGAG
R-EPHA4-gRNA UP1 5’TAGGCTCAAGGTCTCCGGAGGC
R-EPHA4-gRNA DOWN1 5’AAACGCCTCCGGAGACCTTGAG
靶點2:
CCC GGCGAATGAAGGTAAGAG
R-EPHA4-gRNA UP2 5’TAGGCTCTTACCTTCATTCGCC
R-EPHA4-gRNA DOWN2 5’AAACGGCGAATGAAGGTAAGAG
- 合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構建完成的sgRNA載體通過體外轉錄成為可注射的sgRNA。
- 構建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA。
- 顯微注射
- 超數排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進行超排。
- 受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。
- 雄鼠結扎：制作30只8周齡輸精管結扎的SD雄鼠。
- 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
- 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。
- 基因型鑒定
- 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。
- 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA
- PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物并進行PCR檢測。
- 結果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
- 根據測序結果確定Epha4敲除模型大鼠（SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續實驗。
3.1.5.2 Epha4敲除大鼠的建立
根據3.1.5.1獲得Epha4-/-大鼠F1代后，首先通過8周齡左右Epha4-/-與野生型大鼠進行雜交，獲得一定數量的Epha4+/-大鼠。之后使8周齡左右Epha4+/-大鼠進行第二輪雜交，可得到Epha4-/-大鼠，用于后續實驗。
3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取
在幼崽出生后剪腳趾標記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒說明書按以下程序操作。
- 加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。
- 12000 rpm 離心5 min，轉移上清于一無菌的離心管中。
- 加入500 μLBB2，立即渦旋5 s，室溫孵育10 min。
- 將全部的溶液加入離心柱中，8000 rpm離心1 min，棄掉流出液。
- 加入500 μL CB2溶液，12000 rpm離心1 min，棄掉流出液。
- 重復步驟（5）一次。
- 加入500 μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000 rpm 離心1 min，棄掉流出液。
- 重復步驟（7）一次。
- 10000 rpm 離心2 min，徹底去除殘留的WB2。
- 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5 min，在柱的中央加入50~200 μL預熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3 min，12000 rpm 離心2 min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。
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