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C9ORF72基因HRE敲入大鼠模型

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發布時間：2025-07-25 08:49:03 更新時間：2025-09-14 15:06:09

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作者：中科光析科學技術研究所檢測中心

資源中文名稱

C9ORF72基因HRE敲入大鼠

資源英文名稱

C9ORF72 HRE knock in rat

疾病概述

　　肌萎縮側索硬化（ALS）也叫運動神經元病（MND），后一名稱英國常用，法國又叫夏科（Charcot）病，而美國也稱盧伽雷（Lou Gehrig）病。我國通常將肌萎縮側索硬化和運動神經元病混用。它是上運動神經元和下運動神經元損傷之后，導致包括球部（所謂球部，就是指的是延髓支配的這部分肌肉）、四肢、軀干、胸部腹部的肌肉逐漸無力和萎縮。患病率約為4-6/10萬。大約10%的ALS病例是家族型的，90%是散發型的。　　2018年5月11日，國家衛生健康委員會等5部門聯合制定了《第一批罕見病目錄》，肌萎縮側索硬化被收錄其中。

實驗動物背景信息

SD大鼠

模型制作方法

3.1 實驗材料

3.1.1 實驗動物

SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.

3.1.2實驗儀器

儀器及耗材	生產廠商
NanoZoomer S60數字病理切片掃描儀	日本濱松光子學株式會社
Vevo770小動物超聲影像系統	VisualSonics
激光共聚焦掃描顯微鏡	Leica
透射電子顯微鏡	JEOL
顯微注射儀	Nikon
光學顯微鏡	Nikon
化學發光凝膠成像系統	BIO-RAD
PCR儀	BIO-RAD
組織脫水機	Leica
石蠟切片機	Leica
石蠟包埋機	Leica
冰凍切片機	Leica
電泳儀	BIO-RAD
電泳槽	Tanon
數碼凝膠圖像處理系統	Tanon
組織勻漿機	POLYTRON
恒溫培養箱溫控振蕩箱	Incucell TAITEC
離心機	Eppendorf
搖床	SCILOGEX
塑料薄膜封口機	德清拜杰有限公司
電動鼓風干燥箱	天津市泰斯特儀器有限公司
電子稱量器（量程0.5g-620g）	奧豪斯儀器（常州）有限公司
電子稱量器（量程0.1mg-220g）	Sartorius
4℃冰箱	海爾集團
-80℃冰箱	SANYO
-20℃冰箱	SANYO
渦旋振蕩器	上海滬西分析儀器廠
移液器	Eppendorf

3.1.3實驗試劑

試劑	生產廠商
體外轉錄用試劑盒	Ambion
Taq DNA聚合酶	TaKaRa
T7 轉錄試劑盒	Invitrogen
T4 DNA裂連接	TaKaRa
膠回收試劑盒	Qiagen
質粒提取試劑盒	Axygen
Trizol試劑	Invitrogen
逆轉錄試劑盒 DNA提取試劑盒	Invitrogen 北京全式金生物科技有限公司
C9orf72（66140-1-lg）抗體	proteintech
Purified Mouse Anti-GM130（610822）	BD
Anti-Giantin antibody (ab37266)	Abcam
Anti-Rab5 antibody (ab18211)	Abcam
Anti-RAB7 antibody (ab137029 )	Abcam
Anti-Rab11 antibody (ab3612)	Abcam
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 （A11029 ）	Invitrogen
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 （A21424 ）	Invitrogen
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 （A31572）	Invitrogene
GADPH	Santa Cruz Biotechnology
NC膜	Millipore
化學發光液	Immuno Cruz
蛋白質分子量標記物	Takara
蛋白酶抑制劑	羅氏
組織裂解液	Thermo
麗春紅	Beyotime
BCA試劑盒	Beyotime
Western blot 洗液（10×）	Beyotime
30%Acr-Bis	Beyotime
SDS-PAGE電泳液	Beyotime
Western blot轉膜液（粉劑）	Beyotime
TEMED	Beyotime
過硫酸銨	Beyotime
1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）緩沖液	Beyotime
1 M Tris·HCl（pH=6.8）緩沖液	Beyotime
瓊脂	BD公司
異丙醇	北京化工廠
脫脂奶粉	內蒙古伊利實業集團股份有限公司

3.1.4模型構建流程

設計方案

構建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據基因信息選擇靶點并合成sgRNA。

靶點1:

agtcccacgaggaaacag cgg

靶點2:

aggcaaccagagcgctgg cgg

合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構建完成的sgRNA載體通過體外轉錄成為可注射的sgRNA。
構建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA。
顯微注射

超數排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進行超排。
受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。
雄鼠結扎：制作30只8周齡輸精管結扎的SD雄鼠。
受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。

基因型鑒定

剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。
基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA
PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物并進行PCR檢測。

結果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
根據測序結果確定C9ORF72基HRE敲入模型大鼠（SD. C9ORF72 (tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續實驗。

動物模型的評價與驗證

保存方式

冷凍保存、活體繁殖

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