黑色素瘤GPR68Ko小鼠皮下移植瘤模型_模型

C57BL/6J小鼠

包括實驗材料（實驗動物、試劑、儀器）、實驗環(huán)境、細(xì)胞培養(yǎng)/載體構(gòu)建/蛋白表達(dá)/病原培養(yǎng)鑒定方法、實驗操作規(guī)程、動物處理倫理等內(nèi)容。

（一）GPR68 Ko小鼠的構(gòu)建

1、實驗設(shè)計

根據(jù)GPR68蛋白保守區(qū)和基因組結(jié)構(gòu)，設(shè)計需要刪除的外顯子。GPR68基因存在多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但根據(jù)GPR68基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能保守區(qū)，只有一個蛋白編碼區(qū)exon1。因此在exon1的兩邊設(shè)計gRNA靶點，將exon1進(jìn)行全身性敲除。

圖2 插入位點設(shè)計

2、Cas9/gRNA的活性檢測

采用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶點效率檢測試劑盒檢測gRNA靶點體外酶切活性。選體外活性高的gRNA顯微注射受精卵，取胚胎檢測內(nèi)源活性。根據(jù)Cas9/gRNA的內(nèi)源活性結(jié)果，選用活性較高的gRNA進(jìn)行后續(xù)實驗。

3、基因敲除小鼠的建立和和品系交配

選取活性高的CRISPR體外轉(zhuǎn)錄成RNA，顯微注射到小鼠受精卵中，得到發(fā)生基因突變的首建者小鼠（founder）。對小鼠進(jìn)行基因型鑒定，獲得發(fā)生期望突變的founder小鼠。通過基因組DNA的PCR進(jìn)行基因型的鑒定，若發(fā)生DNA片段刪除，將出現(xiàn)特異的縮短的PCR產(chǎn)物。

4、穩(wěn)定遺傳的Gpr68敲除小鼠品系的建立

將帶有突變的founder小鼠與野生型小鼠交配，得到基因突變的雜合子小鼠（+/-）F1代，并進(jìn)行DNA測序，確認(rèn)目標(biāo)基因發(fā)生的DNA片段刪除，從而目標(biāo)蛋白被失活，實現(xiàn)基因敲除。

基因型相同的雜合子小鼠（+/-）相互交配，得到基因敲除的純合子小鼠（-/-）F2代。大約有1/4幾率的F2后代小鼠是基因敲除的純合體小鼠。

（二）皮下移植黑色素瘤模型的構(gòu)建

1、用0.25%胰酶消化細(xì)胞收集細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000rpm離心5min，洗滌細(xì)胞兩次，除去單細(xì)胞懸液中的血清。

2、對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，用PBS稀釋細(xì)胞至濃度為2.5×10⁶個/mL，接種體積控制在0.2mL。

3、采用1mL無菌注射器于小鼠腋下部位接種細(xì)胞。接種時將單細(xì)胞懸液充分混勻，防止細(xì)胞成團(tuán)導(dǎo)致活性降低以及接種細(xì)胞數(shù)不均，左手固定小鼠，右手執(zhí)注射器，針頭在皮下穿行時避免刺破皮膚與肌肉，到達(dá)接種位點并注射完畢后退出針頭時避免細(xì)胞懸液溢出。

4、每3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，測量腫瘤最長和最短直徑。腫瘤體積計算公式為V=a×b²/2(a為長軸，b為短軸)。

5、接種后第20天實驗結(jié)束，采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖取出腫瘤組織，稱量小鼠腫瘤重量、脾臟重量。

在無特殊刺激的情況下，GPR68-/-小鼠沒有明顯表型，且外觀與同背景WT小鼠無明顯差異。分別從DNA、mRNA、蛋白水平檢測GPR68-/-小鼠組織中GPR68表達(dá)，如圖3所示，在此三個水平上均不能檢測到GPR68。

圖3 鑒定GPR68-/-小鼠組織中GPR68的表達(dá)

a.鼠尾DNA的鑒定；b.脾臟T細(xì)胞的mRNA鑒定；c.脾臟T細(xì)胞的蛋白鑒定

分別對WT與GPR68-/-小鼠進(jìn)行皮下注射接種5×10⁵個B16細(xì)胞，觀察并檢測腫瘤生長情況。接種后第20天，采用頸椎脫臼法處死小鼠，稱量小鼠腫瘤重量、脾臟重量。如圖4所示，與WT小鼠比較，GPR68-/-小鼠能夠明顯抑制黑色素瘤的發(fā)展，GPR68-/-小鼠脾臟增大，但二者體重?zé)o明顯差異.

圖4 GPR68敲除對黑色素瘤生長的抑制作用