黑色素瘤GPR68Ko小鼠皮下移植瘤模型_模型
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發(fā)布時間:2025-07-25 08:49:03 更新時間:2025-09-14 15:06:07
點擊:83
作者:中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心
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| 資源中文名稱 | 黑色素瘤GPR68 Ko小鼠皮下移植瘤模型_ | 
|---|---|
| 資源英文名稱 | Modle of transplanted melanoma in GPR68 Ko mice | 
| 疾病概述 | 黑色素瘤指有惡性變化的色素斑痣,是由交界痣或混合痣性質(zhì)的痣發(fā)展而來。雖然不一定由斑痣惡變,但是慢性刺激和不恰當(dāng)?shù)闹委煂Π唣朕D(zhuǎn)變成黑色素瘤有很大的關(guān)系。黑色素瘤表現(xiàn)為黑痣突然出現(xiàn)或迅速長大,色澤不斷加深,四周出現(xiàn)彗星狀小瘤或色素環(huán),局部發(fā)生疼痛、感染、潰瘍或出血,出現(xiàn)腫大的淋巴結(jié)。腫瘤為單一實性,常有包膜,顏色可黑色、紅棕色,深淺程度不一,也可無色素性。大多數(shù)黑色素瘤是原發(fā)性的,累及成人和兒童,特別是有神經(jīng)皮膚癥狀的兒童。腫瘤好發(fā)于下肢,其次是頭、頸、上肢、眼、指甲下和陰唇等處。早期即能由淋巴道和血行轉(zhuǎn)移至肝、腦、骨、黏膜等處。經(jīng)常受摩擦的手掌、足底和眼部的黑痣以及位于表皮和真皮交界處的黑痣容易惡變,被認(rèn)為是黑色素瘤的前驅(qū)期。 | 
| 實驗動物背景信息 | C57BL/6J小鼠 | 
| 模型制作方法 | 包括實驗材料(實驗動物、試劑、儀器)、實驗環(huán)境、細(xì)胞培養(yǎng)/載體構(gòu)建/蛋白表達(dá)/病原培養(yǎng)鑒定方法、實驗操作規(guī)程、動物處理倫理等內(nèi)容。 (一)GPR68 Ko小鼠的構(gòu)建 1、實驗設(shè)計 根據(jù)GPR68蛋白保守區(qū)和基因組結(jié)構(gòu),設(shè)計需要刪除的外顯子。GPR68基因存在多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,但根據(jù)GPR68基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能保守區(qū),只有一個蛋白編碼區(qū)exon1。因此在exon1的兩邊設(shè)計gRNA靶點,將exon1進(jìn)行全身性敲除。 
 圖2 插入位點設(shè)計 2、Cas9/gRNA的活性檢測 采用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶點效率檢測試劑盒檢測gRNA靶點體外酶切活性。選體外活性高的gRNA顯微注射受精卵,取胚胎檢測內(nèi)源活性。根據(jù)Cas9/gRNA的內(nèi)源活性結(jié)果,選用活性較高的gRNA進(jìn)行后續(xù)實驗。 3、基因敲除小鼠的建立和和品系交配 選取活性高的CRISPR體外轉(zhuǎn)錄成RNA,顯微注射到小鼠受精卵中,得到發(fā)生基因突變的首建者小鼠(founder)。對小鼠進(jìn)行基因型鑒定,獲得發(fā)生期望突變的founder小鼠。通過基因組DNA的PCR進(jìn)行基因型的鑒定,若發(fā)生DNA片段刪除,將出現(xiàn)特異的縮短的PCR產(chǎn)物。 4、穩(wěn)定遺傳的Gpr68敲除小鼠品系的建立 將帶有突變的founder小鼠與野生型小鼠交配,得到基因突變的雜合子小鼠(+/-)F1代,并進(jìn)行DNA測序,確認(rèn)目標(biāo)基因發(fā)生的DNA片段刪除,從而目標(biāo)蛋白被失活,實現(xiàn)基因敲除。 基因型相同的雜合子小鼠(+/-)相互交配,得到基因敲除的純合子小鼠(-/-)F2代。大約有1/4幾率的F2后代小鼠是基因敲除的純合體小鼠。 (二)皮下移植黑色素瘤模型的構(gòu)建 1、用0.25%胰酶消化細(xì)胞收集細(xì)胞懸液,用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞,1000rpm離心5min,洗滌細(xì)胞兩次,除去單細(xì)胞懸液中的血清。 2、對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),用PBS稀釋細(xì)胞至濃度為2.5×106個/mL,接種體積控制在0.2mL。 3、采用1mL無菌注射器于小鼠腋下部位接種細(xì)胞。接種時將單細(xì)胞懸液充分混勻,防止細(xì)胞成團(tuán)導(dǎo)致活性降低以及接種細(xì)胞數(shù)不均,左手固定小鼠,右手執(zhí)注射器,針頭在皮下穿行時避免刺破皮膚與肌肉,到達(dá)接種位點并注射完畢后退出針頭時避免細(xì)胞懸液溢出。 4、每3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小,測量腫瘤最長和最短直徑。腫瘤體積計算公式為V=a×b2/2(a為長軸,b為短軸)。 5、接種后第20天實驗結(jié)束,采用頸椎脫臼法處死小鼠,解剖取出腫瘤組織,稱量小鼠腫瘤重量、脾臟重量。 | 
| 模型表型數(shù)據(jù) | 在無特殊刺激的情況下,GPR68-/-小鼠沒有明顯表型,且外觀與同背景WT小鼠無明顯差異。分別從DNA、mRNA、蛋白水平檢測GPR68-/-小鼠組織中GPR68表達(dá),如圖3所示,在此三個水平上均不能檢測到GPR68。 
 圖3 鑒定GPR68-/-小鼠組織中GPR68的表達(dá) a.鼠尾DNA的鑒定;b.脾臟T細(xì)胞的mRNA鑒定;c.脾臟T細(xì)胞的蛋白鑒定 分別對WT與GPR68-/-小鼠進(jìn)行皮下注射接種5×105個B16細(xì)胞,觀察并檢測腫瘤生長情況。接種后第20天,采用頸椎脫臼法處死小鼠,稱量小鼠腫瘤重量、脾臟重量。如圖4所示,與WT小鼠比較,GPR68-/-小鼠能夠明顯抑制黑色素瘤的發(fā)展,GPR68-/-小鼠脾臟增大,但二者體重?zé)o明顯差異. 
 圖4 GPR68敲除對黑色素瘤生長的抑制作用 a.小鼠體重曲線;b.腫瘤生長曲線;c.腫瘤大小;d.腫瘤重量;e.脾臟重量 | 
 
                證書編號:241520345370
 
                證書編號:CNAS L22006
 
                證書編號:ISO9001-2024001
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

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