巨噬細胞特異性PDL1敲除小鼠+CRISPR/Cas9模型

C57BL/6小鼠

包括實驗材料（實驗動物、試劑、儀器）、實驗環(huán)境、細胞培養(yǎng)/載體構(gòu)建/蛋白表達/病原培養(yǎng)鑒定方法、實驗操作規(guī)程、動物處理倫理等內(nèi)容。

（一）巨噬細胞上特異性小鼠制備的原理

條件性基因敲除小鼠的設(shè)計利用了位點特異性重組酶系統(tǒng)Cre/LoxP原理，需要在待敲除的一段目標(biāo)DNA序列的兩端各放置一個loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。將flox小鼠與帶有組織或細胞特異性表達cre的小鼠交配繁殖，以獲得在特定細胞或者組織里把目的基因敲除掉的小鼠，即條件性基因敲除小鼠。

如下圖：

圖1 特異性敲除的原理

（二）條件敲除小鼠的繁殖和鑒定

1.  收到F0和F1小鼠后，首先確認(rèn)每只小鼠的腳趾編號是否吻合。

2.  F0和F1小鼠由于數(shù)量較少，以后需要的動物多，與野生交配，盡量多繁殖，以備后續(xù)的研究。

3. 獲得小鼠后，提取基因組DNA，PCR擴增，進行基因型鑒定，并利用流式進行表型鑒定。

4. 繁殖方法有多種，以下為一種舉例：

首先將PD-L1^Flox/-小鼠和C57BL/6小鼠進行雜交，得到PD-L1^Flox/-小鼠，然后將PD-L1^Flox/-小鼠進行自交，得到PD-L1^Flox/Flox小鼠，將雌性PD-L1^Flox/Flox小鼠和帶有巨噬細胞特異性表達 Cre 酶的Lyz2-iCre雄鼠進行雜交，得到 PD-L1^Flox/- with Cre小鼠，最后將PD-L1^Flox/Flox小鼠和PD-L1^Flox/- with Cre小鼠雜交，得到1/4的PD-L1^Flox/Flox with Cre小鼠，即為巨噬細胞特異性PD-L1敲除小鼠。

備注：PD-L1^Flox/-小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所基因工程平臺采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建。巨噬細胞特異性PD-L1敲除小鼠繁育過程所需的6周齡 SPF 級C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京) 2018－001】，6周齡SPF級雄性Lyz2-iCre小鼠2只，購自南京大學(xué)模式動物中心。小鼠均飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所屏障環(huán)境動物房【SYXK(京)2014－0029】，飼養(yǎng)間溫度( 23 ± 2) ℃，12 /12 h 明暗交替照明，動物自由飲水及采食。動物實驗中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會( IACUC) 的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為 ZLJ19003。