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實驗動物：
8-10周齡SD雄性大鼠，用作種公鼠和結扎公鼠；4-6周齡雌性大鼠，用作超數排卵，8~10周齡雌性大鼠，用作受體。
主要試劑：
孕馬血清促性腺激素(PMSG)，人絨毛膜促性腺激素(hCG)，M2培養液(M7167，Sigma)，M16培養液(M7292，Sigma)，體外轉錄試劑盒(Ambion)，PCR試劑盒(Takara)，luciferaseSSA檢測試劑盒，瓊脂糖等
主要儀器：
低溫超速離心機，PCR儀，電泳儀，Leica體視鏡，顯微注射系統，超凈工作臺，培養皿(BD Falcon)，一次性注射器，無菌手術器械(剪刀、鑷子、血管夾、持針器、手術縫線等)等
實驗環境：
普通實驗室內進行質粒構建與顯微注射。SD大鼠飼養于SPF屏障環境。
實驗操作規程：
- 供體與受體準備
供體雌鼠超數排卵：選擇 4-6 周齡的雌鼠，于腹腔注射 PMSG 20 IU/只，48 h后注射hCG 20 IU/只，按1:1的比例與成年雄鼠合籠，于次日早上觀察雌鼠陰栓，見栓雌鼠取卵用于顯微注射。雄鼠結扎：選8-10周齡雄性大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)麻醉后剪毛，75%酒精消毒，腹中線下方距陰莖2-3 cm處剪開皮膚肌肉，分別分離出兩側輸精管，將鑷子在酒精燈上加熱后燒斷輸精管，關閉腹腔，待恢復2周后用于和雌鼠交配準備受體。受體假孕鼠制備：于取卵前1 d選擇成年雌鼠與結扎雄鼠合籠，次日早上觀察雌鼠陰栓，見栓雌鼠即作為假孕鼠用作受精卵移植。
- TALEN 質粒的準備
TALEN設計靶位點位置: exon2上，kinase 的domain 前5’-T GGACACACGACGTTGGC agggcttccgcctgga GGATTATCTGATAGGAC A-3’。將構建的 TALEN質粒對分別取 10 µg 酶切線性化，酚氯仿抽提、純化后取 1 µg 作模板，按照體外轉錄試劑盒的說明依次加入 NTP/CAP、10×Buffer 及 Enzyme Mix，最后加水至20 µl轉錄體系，于37℃水浴2 h。轉錄后純化、鑒定，分裝保存于-80℃冰箱。
圖1. 組裝后的TALEN質粒。
- 胚胎收集
將見栓雌鼠頸椎脫臼處死，75%酒精消毒后迅速剪開腹腔，分離卵巢輸卵管和子宮，剪下輸卵管置于37℃預熱的M2液滴中，在體式鏡下將輸卵管膨大部劃開，釋放出卵丘-卵母細胞復合體。透明質酸酶消化去除顆粒細胞后，于M2培養液滴中洗3-5次后，移入覆蓋有礦物油的M16培養液中培養以備顯微注射。
- 顯微注射
顯微鏡下觀察可見清晰原核的卵細胞為受精卵，挑選出用于顯微注射。將TALEN質粒對轉錄的mRNA中放入注射針虹吸，注射針尖端充滿液體后安裝于注射儀上，根據注射針的出液量多少調節注射壓力，注射后可見胞質有明顯膨脹表明成功注射入胞質。將成功注射且存活的受精卵用于輸卵管移植。
- 輸卵管移植
將見栓的假孕鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg體重)，背部脊柱兩側肋骨下方剃毛，75%酒精消毒后依次剪開皮膚肌肉，可見白色脂肪體，用鑷子夾住脂肪體向外牽拉出卵巢、輸卵管、子宮，在體視鏡下找到輸卵管膨大部，用血管夾夾住脂肪體以固定輸卵管在鏡下合適的位置，在輸卵管膨大部前方避開血管走形剪開一小口，將移卵管插入開口吹入胚胎，液體后方吹入一氣泡防止液體反流。將脂肪體、卵巢、輸卵管及子宮還納入腹腔，縫合肌肉皮膚。
6. 出生大鼠鑒定 將受精卵移植的假孕鼠
單籠飼養22 d左右后觀察乳鼠出生情況。新生鼠生長至 1 周以上即剪腳趾，消化液 55℃水浴消化過夜后，常規方法提基因組。對目的基因進行 PCR 擴增后送測序鑒定。
動物倫理：
用于實驗的SD大鼠購自維通利華，飼養于SPF屏障環境。飼養條件為溫度(24±2)℃，濕度為(50±10)%，光照周期為6:00~18:00，12 h晝夜交替。本實驗中動物的使用已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會（ICUC）批準（QC18011）。 |
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