選用SPF級2-4歲雄性恒河猴，2.5-3.5kg，來自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所（IACUC 批準號：BLL20001）

1. 實驗材料

    1.1  SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中國疾控中心譚文杰教授提供。

1.2 實驗動物

選用SPF級2-4歲雄性恒河猴，2.5-3.5kg，來自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所（IACUC 批準號：BLL20001）

2. 實驗環境

所有涉及的病毒實驗操作全部在中國醫學科學院醫學實驗動物研究所ABSL-3實驗室完成，該實驗室已經具備相關實驗室和福利倫理資質。

3. 病原培養鑒定

將新型冠狀病毒接種到Vero細胞進行分離和儲存。Vero細胞培養在DMEM（英濰捷基, 美國）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養基中，環境為37°C，5%CO2。新型冠狀病毒的病毒滴度用標準的半數細胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）進行分析。

4. 實驗操作規程

（1） 感染途徑：經氣管感染；

（2） 感染劑量：1×10⁶ TCID50 只；

（3） 感染體積：1ml/只；

（4） 對照組：等體積 PBS。

4.3 動物模型分析

（1）癥狀觀察：感染后，每天觀察動物一般癥狀，記錄體重和體溫等。

（2）病毒載量：定時收集各組動物臟器，進行RNA抽提，利用RT-PCR技術，檢測組織中病毒載量。RT-PCR所用的新型冠狀病毒引物如下：上游為5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游為5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分離：肺組織在 DMEM 溶液中研磨制備成勻漿，離心分離上清后，接種于Vero細胞分離病毒并觀察細胞病變。

（4）影像學檢查：感染后 0,3,5,7,9,11,13,15天做X-RAY檢測。

（5）病理學觀察 用新鮮的組織福爾馬林固定，制備石蠟切片，用HE，免疫組化或熒光染色，鏡下觀察。

（6）免疫學檢測：感染后第3，4，6，7，11，14天全血進行白細胞、淋巴細胞、單核細胞檢查和CD3+,CD4+,CD8+,巨噬細胞，單核細胞，以及血清中特異性抗體。

4.4 數據統計處理方法

所有的數據用GraphPad Prism 6.0 軟件分析，感染組小鼠和其他對照組小鼠用T 檢驗方法分析差異，顯著性差異用*p ＜ 0.05, p＜0.01 或者 #p＜0.05, ##p＜0.01 表示。

1. 表觀效度：

我們以體重、體溫等來評價模型的癥狀表型。恒河猴感染模型并無明顯臨床癥狀。

2. 結構效度：

感染后第11天檢測恒河猴的肺部影像學改變，右肺上葉透亮度減低內可見增粗肺紋理，呈磨玻璃密度改變，水平裂可見，呈細線狀。第13天右肺上葉透亮度進一步減低，肺紋理增粗，部分顯示不清，水平裂不均勻增厚；左肺上葉肺條理增粗，呈磨玻璃密度改變。第15天時，右肺上葉實變，邊緣模糊，內可見支氣管像，水平裂增厚；左肺上葉肺條理增粗，呈磨玻璃密度改變，與臨床患者影像學相似。病理分析結果顯示肺組織呈輕度到重度間質性肺炎，可模擬多數新冠患者的病理表型。另外免疫學的檢測結果也與臨床患者接近。

3. 預測效度：

目前沒有確證有效的陽性藥物。