6~8 周齡 SPF 級雌性 C57BL/6N 小鼠

1.1實驗材料

 C57BL/6N 小鼠（北京維通利華，SCXK (京)-2016-0006），右旋糖酐鐵注射液（江西創導動物保健品有限公司），血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白及可溶性轉鐵蛋白受體檢測試劑盒（酶免公司），組織鐵檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），普魯士藍染色試劑盒（Solarbio），結核分枝桿菌標準株 H37Rv（菌號為 93009，本室保存），中性羅氏培養管（珠海貝索生物），BACTEC MGIT 7H9 98 分枝桿菌快速培養管（BD 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 鐵過載小鼠模型建立

 6~8 周齡 SPF 級雌性 C57BL/6N 小鼠隨機分成陰性對照、低劑量、中劑量和高劑量 4 個小組，實驗組分別腹腔注射右旋糖酐鐵3.75、7.5、15 mg/次，陰性對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，3 次/周，共計 4 周。定期觀察小鼠生長及精神狀態，稱重并記錄。動物實驗經本所實驗動物管理和使用委員會（IACUC）批準，批準號為：ZLJ2019001。

1.2.2 血清生化指標與組織鐵含量測定 

 建模完成后將小鼠摘眼球采血，4 ℃凝結過夜，2000 g 4 ℃離心 10 min，分離小鼠血清并檢測血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白及可溶性轉鐵蛋白受體含量。解剖取小鼠心臟，肝臟、脾臟、肺、腎臟及小腸等組織器官，稱重后加 1ml 生理鹽水充分研磨并裂解組織碎片，12000 g 4 ℃離心 20 min，取上清并測定蛋白濃度。 血清生化檢測按試劑盒說明書進行，組織鐵測定則按試劑盒測定方法計算相同蛋白濃度下各組織鐵含量。

1.2.3 鐵過載小鼠 Mtb 感染

SPF 級 C57BL/6N 隨機分成空白對照組、空白 Mtb 感染組、中劑量鐵過載模型組和中劑量鐵過載模型 Mtb 感染組，每組 6 只。其中 Mtb 感染組小鼠經尾靜脈注射對數生長期 H37Rv 單細胞菌懸液 100 μl（1×10 ⁶ CFU/ml），空白對照組注射等劑量無菌生理鹽水。本所 ABSL-3 實驗室（國衛 ABSL3-059） 正常飼喂， 觀察并記錄小鼠臨床表現，感染后 4 周解剖小鼠。

1.2.4 小鼠組織荷菌量測定

ABSL-3 實驗室動物解刨臺中解剖感染小鼠，無菌取小鼠肺、脾和肝臟組織；拍照記錄肺、脾和肝臟等器官大體病變情況，取小鼠左肺、脾頭及肝小葉于生物 安全柜內稱重，依次經 2%稀硫酸溶液、生理鹽水漂洗 30 s，1 ml 生理鹽水溫和 勻漿后進行 10倍倍比稀釋，分別取 10^-3，10^-4和 10 ^-5 稀釋液 50 µl 均勻涂布于中性羅氏培養管內，37℃培養 4 周，計算相應的組織器官荷菌量。另取 10 ^-1稀釋液 500 μl 接種于 BD BACTEC MGIT 960 培養系統，通過記錄報陽時間進行結核菌的快速檢測。

1.2.5 組織切片

HE染色與鐵染色 小鼠各組織器官，10%中性福爾馬林溶液固定 48 h。組織按長軸最大橫切面修塊、梯度乙醇脫水、石蠟包埋并切成 5 µm 厚度切片，HE 染色后掃描載玻片并保存為 NanoZoomer 數字病理圖像，不同視野下拍照并進行組織病理學分析。鐵染色組織切片脫蠟至水，切片入 Perls 染液浸染 20 min，蒸餾水充分沖洗切片5 min，入核固紅染色液，淡染細胞核 10 min，自來水沖洗 5 s。常規脫水透明，中性樹膠封固，晾干后拍照觀察其病理形態改變及鐵沉積程度。

1.3 統計學分析  

SPSS16.0 進行統計學處理，結果以平均數±標準差表示。不同實驗處理組之間差異比較采用單因素方差分析，P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。柱形圖采用 GraphPad Prism 5 軟件制作。

1、 表型分析

1.1 鐵過載小鼠組織形態及體重評估

鐵過載小鼠外觀與正常小鼠無明顯區別，自主活動穩定，精神狀態平穩。 解剖后正常小鼠各臟器組織表面光滑，無充血、水腫。鐵過載小鼠肝臟顏色呈暗褐色，且隨著右旋糖酐鐵劑量增加而逐漸加深，其他臟器組織無明顯顏色及形態 變化（圖 1）。低劑量組、中劑量組與陰性對照組相比體重增長無顯著差異。高劑量組體重增長略有減緩，且與其他劑量實驗組及陰性對照組比較差異有明顯統計學意義( 圖 2，P ＜ 0.05)。

            圖 1. 不同劑量鐵過載小鼠肝臟變化

           圖 2. 不同劑量鐵過載小鼠體重增長百分比

*表示高劑量組與低劑量組、中劑量組及陰性對照組比較，P ＜0.05。

   2.2 鐵過載小鼠組織鐵含量變化

  鐵過載小鼠中肝組織含鐵量最高，與陰性對照組小鼠相比增加接近 7 倍。 其次，組織鐵含量由高至低依次為脾臟，腎臟及小腸。高劑量組和中劑量組各臟器組織鐵含量均顯著高于陰性對照組（圖 3，P 均 ＜ 0.05），低劑量組小鼠心臟和肺組織鐵含量顯著低于其他劑量組，與陰性對照組相比無顯著性差異（圖 3， P ＞ 0.05）。

            圖 3. 不同劑量鐵過載小鼠組織含鐵量

*表示各不同劑量組與陰性對照組比較，P ＜0.05；表示各不同劑量組與陰性對照組比較，P ＜0.01。

2.3 鐵過載血生化指標變化

鐵過載小鼠分別于鐵劑注射 4 周后取外周血血清進行血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白和可溶性轉鐵蛋白受體檢測，結果如圖 4 所示。陰性對照組和各不同劑量鐵劑組小鼠血清鐵水平分別為19.95 ± 5.64 μmol/L、43.00 ± 6.82 μmol/L、65.84 ± 167 9.31 μmol/L 和 108.45 ± 9.90 μmol/L，組間差異有明顯統計學意義 (圖 4，P 均 ＜ 0.05) 。進一步檢測各組動物外周血鐵蛋白水平分別為 773.82 ± 161.51 μg/L、 169 1063.68 ± 65.15 μg/L、1344.08 ± 168.57 μg/L 和 1694.73 ± 44.45 μg/L，組間差異同樣有明顯統計學意義( 圖 4，P 均 ＜ 0.05) 。然而，各劑量組小鼠轉鐵蛋白和可溶性轉鐵蛋白受體水平與正常對照組小鼠相比均無顯著差異（圖 4，P ＞ 0.05）。

圖 4. 不同劑量鐵過載小鼠血清鐵、鐵蛋白、轉鐵蛋白和可溶性轉鐵蛋白受體水平

(a)：血清鐵，(b)：血清鐵蛋白，(c)：血清轉鐵蛋白，(d)：血清可溶性轉鐵蛋白受體。*表示各不同劑量組與陰性 對照組比較，P ＜0.05；表示各不同劑量組與陰性對照組比較，P ＜0.01。

3、病理表型

鐵過載小鼠組織HE 染色與鐵染色鐵過載模型中高劑量組小鼠肝臟、脾臟和腎臟組織 HE 染色均可見大量團狀含鐵血黃素沉積。肝細胞核固縮、溶解，胞漿內滿布蛋白微粒；脾小體與紅髓區界限不清；小腸及心臟組織可見部分含鐵血黃素沉積，心肌纖維出現排列異常，炎性細胞浸潤，充血水腫、出血等病理變化；肺部可見小數鐵蛋白微粒，支氣管和血管周圍及其管腔內炎性細胞浸潤，嗜酸性粒細胞及淋巴細胞滲出，并可見肺泡不均勻擴張，肺泡間隔斷裂等。中劑量組和低劑量組僅肝臟和脾臟可見含鐵血 黃素沉，且含鐵血黃素沉程度與鐵劑量成正相關；心臟、肺、腎臟及小腸等組織未見明顯含鐵血黃素沉積及炎性細胞浸入，與陰性對照組相比無明顯變化（圖6）。普魯士藍染色與組織鐵含量測定結果一致，陰性對照組小鼠各組織鐵染色為陰性，高劑量組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和小腸等組織大量胞外鐵和胞內鐵呈顆粒狀、塊狀亮藍色鐵沉積。中劑量組肝臟和脾臟組織鐵沉積較明顯， 心臟、肺、腎臟和小腸僅可見小量鐵沉積，均未見組織形態改變。低劑量組小鼠中心臟和肺組織則未見明顯鐵沉積，與陰性對照組相比無顯著改變（圖 7）。

圖 6. 不同劑量鐵過載小鼠組織 HE 染色（× 20）

圖 7 不同劑量鐵過載小鼠各組織普魯士藍染色（× 20）

圖 7. 結核感染鐵過載小鼠肺脾肝組織病理變化（× 20）

3 鐵過載結核病小鼠組織荷菌量

對中劑量右旋糖酐鐵建立的鐵過載小鼠模型進行 Mtb 感染試驗，感染后 4 周解剖并進行肺、脾和肝臟病理分析和荷菌量檢測，結果表明鐵過載結核病小鼠構建成功。如圖 7 所示，肺脾及肝組織病理 HE 染色中鐵過載 Mtb 感染組肺組織出現多處炎癥反應，呈實變趨勢，其中肺泡壁增厚，肺泡腔被淋巴細胞等炎癥細胞填充。結核性肉芽腫顯著增加且多于空白 Mtb 感染組。脾臟白髓被結核肉芽腫病變破壞，可見炎癥細胞聚集，且病變較重。同樣，鐵過載 Mtb 感染小鼠肝臟可見水腫、淤血，光鏡下肝細胞內可見團塊狀鐵褐色沉積，Mtb 感染后出現多個散在小肉芽腫樣病變。同時，感染小鼠肺、脾臟和肝組織荷菌量比較發現，鐵過載 Mtb 感染組荷菌量比空白 Mtb 感染組各靶器官較高，且具有統計學差異（圖 8，P 均 ＜ 0.05）。

圖 8 結核感染鐵過載小鼠肺脾肝組織荷菌量分析

（一）模型的評價

    本模型采用的評價主要采取以整體表觀效度的評價方法，本模型分為鐵過載模型和結核感染模型兩部分。鐵過載模型的核心指標鐵過載小鼠外周血血清鐵和鐵蛋白水平隨鐵劑注射量增加而升高，轉鐵蛋白和可溶性轉鐵蛋白受體無明顯變化。動物各臟器組織 HE與普魯士藍染色結果發現，鐵過載動物各臟器均出現不同程度鐵沉積，且高劑量鐵劑引發小鼠肝腎損傷。

結核菌感染模型的核心指標是感染期的組織病變和荷菌量，鐵過載小鼠感染結核菌后，鐵過載動物肺脾肝組織結核性病變嚴重，且荷菌量較空白 Mtb 感染組增加，綜合組織荷菌量和病變指標可以評價該模型。

（二）模型的驗證

通過設置對照組，判定模型的成功與否，并且本模型已至少通過3個批次的實驗來重復驗證，參數指標穩定。