1、藥品與試劑
Amyloid β 蛋白片段1-40（也有采用Aβ1-28、Aβ1-42或者Aβ25-35）；水合氯醛（或其它麻醉藥物如戊巴比妥鈉）；無菌生理鹽水（或PBS或雙蒸水）；H2O2溶液；青霉素鈉粉。
脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)，臨用前配制成不同濃度備用，通常使用無菌生理鹽水或人工腦脊液稀釋，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行選擇；麻醉藥物水合氯醛或戊巴比妥鈉；30% H2O2溶液；青霉素鈉粉末或注射液。
2. 實(shí)驗(yàn)儀器
腦立體定位儀、微量注射泵、微量注射器、手術(shù)剪、手術(shù)鑷子、縫合針線等。
3. 實(shí)驗(yàn)方法
3.1. 藥品制備
Aβ1-40溶液：臨用前將Aβ1-40溶于無菌生理鹽水（或PBS或雙蒸水）中配制成1 μg/μL母液，置于37 ℃孵育7天，使其聚集、老化，分裝后，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>
10%(m/v)水合氯醛溶液：稱取水合氯醛10g，加入生理鹽水定容至100 mL，備用。
3.2. 手術(shù)（以大鼠為例，小鼠操作參照此進(jìn)行）
（1）定位參照George Paxinos的腦立體定位圖譜及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，基本步驟如下：
（2）動(dòng)物稱重，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉；
（3）將大鼠頭頂局部用動(dòng)物去毛器去毛，消毒，并固定于腦立體定位儀上；
（4）大鼠頭頂處正中矢狀切口，使用眼科剪剪開切口長約2cm，用棉棒沾少許H2O2清除骨膜，并用手術(shù)刀片將殘物刮除干凈暴露十字縫，確定前后囟，并使之處于同一平面；
（5）坐標(biāo)定位
大鼠：
海馬：取前囟后AP：-3.3 mm，正中矢狀縫左右旁開ML：±2.0 mm處使用牙科鉆鉆孔，進(jìn)針深度為DV：3.0 mm （如圖1A）；
側(cè)腦室：取前囟后AP：-0.9 mm，正中矢狀縫左右旁開ML：±1.5 mm處使用牙科鉆鉆孔，進(jìn)針深度為DV：3.8 mm（如圖1B）；
小鼠：
海馬：取前囟后AP：-2.46 mm，正中矢狀縫左右旁開ML：±2.2 mm處使用牙科鉆鉆孔，進(jìn)針深度為DV：2.1 mm （如圖2A）；
側(cè)腦室：取前囟后AP：-0.3 mm，正中矢狀縫左右旁開ML：±1.0 mm處使用牙科鉆鉆孔，進(jìn)針深度為DV：2.5 mm（如圖2B）；
（以上坐標(biāo)為較常見值，亦有許多其他坐標(biāo)，實(shí)驗(yàn)坐標(biāo)值以自己預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為主。）
（6）將微量注射器固定于注射泵臂上，緩慢插入鉆孔，單側(cè)海馬注射Aβ1-40溶液5 μL，注射速度為1 μL/min，留針5min后緩慢撤針；
（7）注射完畢后將青霉素鈉鹽少許撒于創(chuàng)口處縫合皮膚。
（8）動(dòng)物手術(shù)后觀察5-7天，剔除狀態(tài)不好的動(dòng)物。
4、行為實(shí)驗(yàn)
動(dòng)物手術(shù)后觀察5-7天，剔除狀態(tài)不好的動(dòng)物。利用行為學(xué)設(shè)備開展學(xué)習(xí)記憶行為實(shí)驗(yàn)檢測。
A
B
圖 1 大鼠腦立體定位圖
（CA1-3海馬CA1-3區(qū)，LV側(cè)腦室）
A
B
圖 2 小鼠腦立體定位圖
（CA1-3海馬CA1-3區(qū)，LV側(cè)腦室）
圖 3 大鼠海馬立體定位注射實(shí)物圖
5. 注意事項(xiàng)
（1）模型建立應(yīng)嚴(yán)格按照定位圖譜進(jìn)行，撤針時(shí)要求緩慢（5min），以防注射的注射藥物通過針道溢出；
（2） 采用冰凍切片，有利于快速病理染色以證實(shí)是否到達(dá)注射點(diǎn)；
（3）取材時(shí)應(yīng)取前囟后2～5 mm腦組織冠狀切片，以防止取材過多或錯(cuò)過注射點(diǎn)。
6. 模型分析指標(biāo)
6.1 水迷宮
圓形迷宮直徑為159cm、高50cm，池中水深25. 5cm 左右，內(nèi)置平臺直徑9cm、高24cm，水溫維持在( 24 ± 1) ℃。將迷宮置于空間信息相對豐富的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，作為動(dòng)物學(xué)習(xí)過程中的空間參照物，整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)保持環(huán)境信息固定不變。將迷宮均分為4個(gè)象限，將平臺置于其中一個(gè)象限中央，作為實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物逃離水環(huán)境的唯一途徑，空間記憶階段保持平臺位置固定不變。選擇其余3個(gè)象限作為動(dòng)物的入水點(diǎn)將動(dòng)物面向池壁放入水中，每天訓(xùn)練3次，每次變換入水點(diǎn)位置( 使動(dòng)物可分別從3個(gè)象限入水) ，且每天所有動(dòng)物入水點(diǎn)的順序保持一致。每次訓(xùn)練前適應(yīng)10s，使動(dòng)物獲取并學(xué)習(xí)空間環(huán)境信息。設(shè)置檢測時(shí)間為90s 后，將動(dòng)物放入水中，若動(dòng)物在90s 內(nèi)找到平臺，算作尋臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留休息10s。若動(dòng)物在90s內(nèi)未找到平臺，結(jié)束此次訓(xùn)練并記錄潛伏期為90s，并引導(dǎo)動(dòng)物靠近平臺使其在平臺上停留10s。每只動(dòng)物訓(xùn)練的時(shí)間間隔為40min。每天每只動(dòng)物3次訓(xùn)練學(xué)習(xí)的潛伏期平均值，作為評價(jià)動(dòng)物這一天學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。經(jīng)過5d的訓(xùn)練學(xué)習(xí)后，第6天撤去平臺，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。將動(dòng)物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，檢測其在90s內(nèi)穿過原平臺所在位置的次數(shù)，作為評價(jià)空間記憶能力的指標(biāo)。
6.2 被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)包括獲得、鞏固兩個(gè)部分
（1）避暗獲得實(shí)驗(yàn)：睡眠干擾第27天進(jìn)行避暗獲得實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前每只小鼠面向拱門由明室放入，適應(yīng)3min。然后開始學(xué)習(xí)，將小鼠由明室背向拱門放入，當(dāng)其進(jìn)入暗室時(shí)，給予0.5mA（5s）的電擊，共學(xué)習(xí)5min。
（2）鞏固實(shí)驗(yàn)：獲得實(shí)驗(yàn)24h后進(jìn)行避暗鞏固實(shí)驗(yàn)，仍將老鼠按原方式由明室放入，記錄5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)、進(jìn)入暗室的潛伏期、在暗室停留時(shí)間等指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)后將老鼠取出，放回籠中。
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