3.1 實驗材料
3.1.1 實驗動物
SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012-001】。超排用雌鼠數量10-15只，年齡3周齡，交配傳代用野生型SD大鼠為成年8-10周齡大鼠。實驗中基因工程大鼠由本實驗室繁殖產生。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.
3.1.2實驗儀器
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儀器及耗材
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生產廠商
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NanoZoomer S60數字病理切片掃描儀
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日本濱松光子學株式會社
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激光共聚焦掃描顯微鏡
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Leica
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透射電子顯微鏡
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JEOL
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顯微注射儀
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Nikon
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光學顯微鏡
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Nikon
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化學發光凝膠成像系統
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BIO-RAD
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PCR儀
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BIO-RAD
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Realtime PCR儀
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ABI
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冰凍切片機
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Leica
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電泳儀
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BIO-RAD
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電泳槽
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Tanon
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數碼凝膠圖像處理系統
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Tanon
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組織勻漿機
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POLYTRON
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恒溫培養箱
溫控振蕩箱
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Incucell
TAITEC
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離心機
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Eppendorf
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搖床
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SCILOGEX
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塑料薄膜封口機
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德清拜杰有限公司
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電動鼓風干燥箱
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天津市泰斯特儀器有限公司
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電子稱量器（量程0.5g-620g）
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奧豪斯儀器（常州）有限公司
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電子稱量器（量程0.1mg-220g）
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Sartorius
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4℃冰箱
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海爾集團
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-80℃冰箱
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SANYO
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-20℃冰箱
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SANYO
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渦旋振蕩器
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上海滬西分析儀器廠
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移液器
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Eppendorf
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MRI
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西門子
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PET/CT
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西門子
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3.1.3實驗試劑
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試劑
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生產廠商
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體外轉錄用試劑盒
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Ambion
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Taq DNA聚合酶
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TaKaRa
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T7 轉錄試劑盒
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Invitrogen
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T4 DNA裂連接
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TaKaRa
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膠回收試劑盒
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Qiagen
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質粒提取試劑盒
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Axygen
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Trizol試劑
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Invitrogen
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逆轉錄試劑盒
DNA提取試劑盒
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Invitrogen
北京全式金生物科技有限公司
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MBP（MAB42282）抗體
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R&D
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GADPH
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Santa Cruz Biotechnology
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NC膜
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Millipore
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化學發光液
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Immuno Cruz
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蛋白質分子量標記物
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Takara
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蛋白酶抑制劑
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羅氏
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組織裂解液
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Thermo
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麗春紅
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Beyotime
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BCA試劑盒
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Beyotime
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Western blot 洗液（10×）
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Beyotime
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30%Acr-Bis
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Beyotime
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SDS-PAGE電泳液
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Beyotime
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Western blot轉膜液（粉劑）
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Beyotime
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TEMED
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Beyotime
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過硫酸銨
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Beyotime
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1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）緩沖液
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Beyotime
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1 M Tris·HCl（pH=6.8）緩沖液
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Beyotime
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瓊脂
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BD公司
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異丙醇
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北京化工廠
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脫脂奶粉
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內蒙古伊利實業集團股份有限公司
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3.1.4模型構建流程
利用CRISPR/Cas9技術制備MBP敲除大鼠。在MBP基因起始密碼子之前插入Cre重組酶，來構建MBP-Cre大鼠(SD.MBP(tm-Cre)-GC/ILAS)。該模型與Cre 報告大鼠進行雜交(SD.Rosa26(tm-imCherry)-GC/ILAS)，可以檢測MBP基因的表達圖譜，同時通過雜合子交配的方式可以獲得該基因敲除的純合子大鼠，使用PCR方法進行基因型鑒定，使用Western blot技術進行蛋白水平敲除效率的鑒定。
3.1.5 MBP-Cre大鼠的建立
3.1.5.1 MBP-Cre大鼠模型的建立
- 設計方案
圖 1. MBP-Cre大鼠模型構建設計方案
- 構建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據基因信息選擇靶點并合成sgRNA。
靶點1:
R-Mbp-EA-gRNAup: TAGGTGCCCACCCAGCTGACCC
R- Mbp-EA-gRNAdown: AAACGGGTCAGCTGGGTGGGCA
GGCGCTTCTTTAGCGGTGAC AGG
R-Mbp-EB-gRNAup: TAGGCGCTTCTTTAGCGGTGAC
R- Mbp-EB-gRNAdown: AAACGTCACCGCTAAAGAAGCG
合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構建完成的sgRNA載體通過體外轉錄成為可注射的sgRNA。
- 構建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA。
- 顯微注射
- 超數排卵：10-15只3周齡SD雌鼠注射激素進行超排。
- 受精卵注射：取約120枚受精卵進行注射。
- 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
- 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，120枚卵，5只受體鼠）。
- 基因型鑒定
- 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。
- 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA
- PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物并進行PCR檢測。
- 結果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
- 根據測序結果確定MBP-Cre模型大鼠（SD.MBP(tm-Cre)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續實驗。
3.1.5.2 動物繁殖和表達圖譜分析
獲得F0代后，首先通過與野生型大鼠進行雜交，進行基因修飾大鼠傳代能力分析。該模型包含Cre重組酶，可以同時與Cre reporter大鼠（SD.Rosa26(tm-imCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）進行雜交，得到imCherry/MHC-Cre大鼠，進行表達圖譜分析。之后MBP-Cre大鼠通過雜合子與雜合子雜交，獲得MBP-Cre純合子大鼠，進行蛋白表達分析，并用于后續實驗。
圖 2. MBP-Cre大鼠的繁育
3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取
在幼崽出生后剪腳趾標記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒（全式金）說明書按以下程序操作。
- 加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。
- 12000 rpm 離心5 min，轉移上清于一無菌的離心管中。
- 加入500 μLBB2，立即渦旋5 s，室溫孵育10 min。
- 將全部的溶液加入離心柱中，8000 rpm離心1 min，棄掉流出液。
- 加入500 μL CB2溶液，12000 rpm離心1 min，棄掉流出液。
- 重復步驟（5）一次。
- 加入500 μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000 rpm 離心1 min，棄掉流出液。
- 重復步驟（7）一次。
- 10000 rpm 離心2 min，徹底去除殘留的WB2。
- 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5 min，在柱的中央加入50~200 μL預熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3 min，12000 rpm 離心2 min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。
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