RIP(RNA 結合蛋白免疫沉淀)
用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質中內源性的RNA結合蛋白。防止非特異性的RNA的結合。免疫沉淀把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來。結合的RNA序列通過microarray(RIP-Chip)，定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。
RIP 技術（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 結合蛋白免疫沉淀）主要是運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物
沉淀下來，經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA 進行q-PCR驗證或者測序分析。RIP 是研究細胞內RNA 與蛋白結合情況的技術，是了解轉錄
后調控網絡動態過程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色質免疫沉淀ChIP技術的類似應用，但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復
合物，RIP實驗的優化條件與ChIP實驗不太相同，如：RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經RIP實驗驗證等等。
RIP實驗步驟
一、獲取細胞裂解液
- 冷PBS清洗培養皿或培養瓶中的細胞兩次
- 加入冷PBS后用細胞刮將細胞刮下來，收集至eppendoff管
- 1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細胞
- 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞，吹打均勻后于冰上靜置5min
- 每管分裝200μl細胞裂解液，貯存于-80℃
二、制備磁珠-抗體
- 重懸磁珠
- 標記實驗所需的eppendoff管
- 吸取50μl 重懸后的磁珠懸液于每個eppendoff管
- 每管加入500μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩
- 將eppendoff管置于磁力架上，去上清，重復一次
- 用100μl的RIP Wash Buffer重懸磁珠
- 室溫孵育30min
- 將eppendoff管置于磁力架上，棄上清
- 加入500μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后棄上清，重復一次
- 加入500μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后置于冰上
三、RNA結合蛋白免疫沉淀
- 準備RIP Immunoprecipitation Buffer
- 將前上步的eppendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
- 迅速解凍第一步制備的細胞裂解液，離心。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗體復合物中，使得總體積為1ml
- 4℃孵育3h至過夜
- 短暫離心，將eppendoff管放在磁力架上，棄上清
- 加入500μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后將eppendoff管放在磁力架上，棄上清，重復清洗6次
四、RNA純化
- 準備Proteinase K Buffer。每個樣品需150ul
- 用150ul Proteinase K Buffer重懸上述磁珠-抗體復合物
- 55℃孵育30min
- 孵育完之后，將enpendoff管置于磁力架上，將上清液吸入一新的enpendoff管中
- 于每管上清液中加入250μl RIP Wash Buffer
- 于每管加入400μl苯酚：氯仿：異戊醇，渦旋震蕩，室溫下14,000rpm離心10min
- 小心吸取350μl上層水相，吸入另一新的enpendoff管
- 于每管加入400μl氯仿，渦旋震蕩15s，室溫下14,000rpm離心10min
- 小心的吸取300μl上層水相，吸入另一新的enpendoff管
- 每管加入50μl Salt SolutionⅠ，15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer ，850μl 無水乙醇（無RNase），混合，-80℃保持1h至過夜
- 14,000rpm，4℃離心30min，小心去上清
- 用80%乙醇沖洗一次，14,000rpm，4℃離心15min，小心去上清，空氣中晾干.
- 10-20μl DEPC水溶解，-80℃保存。
CMA認證
檢驗檢測機構資質認定證書
證書編號：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認可
實驗室認可證書
證書編號：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認證
質量管理體系認證證書
證書編號：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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