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外源性DNA殘留量檢測

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發布時間：2025-08-03 21:17:30 更新時間：2025-09-15 17:22:31

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作者：中科光析科學技術研究所檢測中心

外源性DNA殘留量檢測是指在生物制品、藥品、疫苗或其他生物樣品中對來自外部來源（如宿主細胞、病毒、細菌或其他污染物）的脫氧核糖核酸（DNA）殘留進行定量分析和評估的關鍵過程。這一檢測在現代生物制藥、基因治療、疫苗開發及食品安全領域中具有極其重要的意義，因為殘留的外源性DNA可能引發免疫反應、導致基因突變、傳播感染或影響產品穩定性。根據國際監管要求，如ICH（國際人用藥品注冊技術協調會）指南，殘留DNA的量必須嚴格控制在安全閾值以下（通常每劑次不超過100 pg），以避免潛在的健康風險。檢測內容不僅包括DNA的定量測定，還涉及DNA來源鑒定（如區分宿主細胞DNA與病毒DNA）、完整性評估（檢查DNA是否片段化）以及生物安全性評價。這一過程是藥品GMP（良好生產規范）和GLP（良好實驗室規范）的重要組成部分，確保產品從研發到上市的全生命周期安全可靠。其應用范圍廣泛，涵蓋單克隆抗體生產、細胞治療產品、重組蛋白藥物等，對預防生物污染、保障公共衛生起到核心作用。

檢測項目

外源性DNA殘留量檢測的核心項目包括多個維度：首先，是總DNA殘留量的定量測定，通常以皮克（pg）或納克（ng）每毫升（或每劑次）為單位，這是確保殘留量低于安全限值的基礎；其次，是DNA來源鑒定，涉及區分不同類型的DNA，如宿主細胞DNA（如CHO細胞或HEK293細胞殘留）、病毒DNA或其他污染物DNA（如細菌DNA），這一項目通過序列特異性分析來確認污染源；第三，是DNA完整性評估，檢查DNA是否發生降解或片段化，因為完整的長鏈DNA可能具有更高的風險，例如更容易整合到宿主基因組中；此外，還包括特定序列檢測項目，如針對高風險病毒（如SV40或EBV）的DNA片段定量，以及殘留DNA的生物活性（如致瘤性或免疫原性）評價。這些項目共同構成了全面的風險評估框架，確保檢測結果能有效指導產品質量控制。

檢測儀器

進行外源性DNA殘留量檢測時，需依賴一系列高精度儀器：實時熒光定量PCR儀（qPCR）是最常用且標準化的設備，它利用熒光探針技術對DNA進行擴增和實時監測，實現高靈敏度定量；微滴式數字PCR系統（ddPCR）則提供更高的準確性和絕對定量能力，通過將樣品分區進行獨立擴增，減少背景干擾，特別適用于低豐度DNA檢測；毛細管電泳儀用于分析DNA片段大小和完整性，例如通過凝膠電泳或芯片電泳來評估降解程度；高通量測序平臺（如Illumina或PacBio系統）則用于深度測序，以全面鑒定DNA來源和序列特征；此外，酶聯免疫吸附測定儀（ELISA）可用于基于抗體的間接檢測方法，而熒光分光光度計（如用于PicoGreen染料法）則直接測量DNA雙鏈的熒光強度。這些儀器的選擇取決于檢測靈敏度（如ddPCR可達0.1 pg/μL）、通量需求和成本因素，確保高效可靠的數據輸出。

檢測方法

外源性DNA殘留量檢測的常用方法包括多種技術路線：定量PCR（qPCR）是主流方法，通過設計特異性引物和探針擴增目標DNA序列，利用熒光信號實時監測來定量殘留量，具有快速、高靈敏度（檢測限可達1-10 pg/mL）的優點；數字PCR（dPCR）作為進階版本，將樣品分成微滴進行獨立擴增，提供絕對定量且抗干擾能力強，適用于復雜基質樣品；雜交法如斑點雜交或Southern blot，用于DNA的定性和半定量分析，尤其適合檢測特定序列；基于測序的方法，如下一代測序（NGS），通過全基因組或靶向測序來鑒定DNA來源和豐度，提供最全面的信息；比色法如PicoGreen法直接結合雙鏈DNA產生熒光，實現快速定量，但靈敏度較低；此外，酶聯免疫法（ELISA-based assays）利用抗體檢測DNA-蛋白復合物。這些方法需結合樣品前處理（如DNA提取和純化），并優化參數如循環數、探針濃度以提高準確度。

檢測標準

外源性DNA殘留量檢測需嚴格遵循國際和國家標準，以確保結果的可比性和合規性：關鍵標準包括ICH Q5A（Quality of Biotechnological Products: Viral Safety Evaluation），它規定了殘留DNA限量（≤100 pg/劑次）和檢測驗證要求；歐洲藥典（Ph. Eur.）章節如2.6.7專門針對DNA殘留檢測提供方法指南；美國藥典（USP）在<1130> Nucleic Acid-Based Techniques中詳細描述qPCR和dPCR方法規范；中國藥典（ChP）也在相關附錄中設定技術標準。此外，ISO標準如ISO 21571（Foodstuffs—Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms）可用于食品安全領域。這些標準強調驗證參數：特異性（確保僅檢測目標DNA）、靈敏度（檢出限≤10 pg/mL）、準確度（回收率85-115%）和精密度（RSD≤15%）。實驗室必須符合GMP/GLP要求，并進行方法轉移和定期復核，以維護檢測可靠性。