卵巢摘除模型

雌性ICR小鼠或者C57Bl/6雌鼠，8-12周齡，造成參考記憶障礙造模時長需4周以上。常規飼養。

1. 卵巢摘除術

結合Merle E及常艷報道的小鼠卵巢摘除術的方法，操作步驟如下：小鼠稱重，4%水合氯醛溶液(400mg/kg bw)腹腔注射麻醉；將小鼠呈俯臥式固定于手術板上，以其兩側后肢大腿根部上緣連線與背部正中線交點以上0.5cm左右為中心，沿背部后中線作一長約0.5-1cm的皮膚切口；沿皮下組織向左側游離大約0.5cm，可見菲薄的肌層下方發亮的脂肪組織；用鑷子提起脂肪團表面肌層，縱行剪開肌層，在脂肪組織中找到左側卵巢；結扎子宮角末端，摘除左側卵巢、輸卵管和一小部分子宮角，縫合剪開的肌層；同法向右游離切除右側卵巢；最后縫合背部皮膚；假手術組除不摘除卵巢外其余操作和模型組相同；術后24h以后對小鼠行至少連續5天的陰道涂片檢查，判斷卵巢摘除是否完全。

圖1卵巢摘除過程

2. 陰道涂片檢查

為評價卵巢摘除是否徹底，術后連續5天每天固定時間行陰道涂片檢查，方法如下：用小鼠灌胃針吸取大約兩滴生理鹽水，在小鼠陰道內吸打3-4次；吸出適量陰道液置于96孔板中，于普通光學顯微鏡下觀察；陰道細胞檢查結果角化細胞均不超過50%判定為卵巢摘除徹底。

3. 模型分析指標

（1）物體認知-新物體識別   實驗過程分為3個階段：適應期、熟悉期、測試期。適應期為3天，每天將動物背對箱體依次放入實驗箱中部位置后開始使之適應實驗箱環境10 min。適應期結束后，次日進行熟悉期和測試期。熟悉期，將兩個完全相同的物體放入實驗箱內相鄰的磁鐵處固定，記錄小鼠5 min內對兩物體的探索行為，比較動物對熟悉物體A1和熟悉物體A2的探索時間來評價動物對物體所在位置是否存在偏愛性，用動物對物體對的總探索時間來評價動物對物體的探索能力是否存在偏差。間隔30 min后開始測試期，將其中一個熟悉物體變換為新物體，另一熟悉物體保持不變。記錄小鼠在測試期內對新穎物體和原熟悉物體的探索時間，用相對辨別指數來評價動物的學習記憶能力。相對辨別指數計算公式為DI = (N-F) /(N+F) ×100%，其中N（new）為動物對新穎物體的探索時間，F（familiar）為動物對原熟悉物體的探索時間。

在實驗過程中，為避免動物對某一位置產生偏愛，物體的位置要相互平衡，以便減少實驗誤差。新物體識別實驗反映的是動物對物體辨別的短時、非空間記憶能力。

（2）避暗實驗  避暗實驗是利用嚙齒類動物趨暗避明的習性設計，當動物進入暗室即遭足底電擊，反復數次后形成條件反射。該實驗用于檢測嚙齒類動物的短時學習記憶和再現能力。實驗分為避暗學習Day1和避暗鞏固Day2兩個階段，歷時2d。

避暗學習階段Day1：首先將避暗實時在線軟件系統設置為：刺激電流1.5mA，刺激電壓30V，實驗時間5min。接著在開始實驗前將動物背朝通道小門放入明室自由活動5min適應測試箱體環境后取出。隨后開始避暗學習實驗，在攝像頭識別到動物第一次進入暗室后，暗室柵欄開始通電，動物遭受電擊會逃到明室，持續5分鐘，實驗結束。避暗學習結束后立即將動物放回睡眠干擾儀內繼續睡眠干擾。

避暗鞏固階段Day2：避暗學習后24h進行。參數設置同前。將動物背朝通道小門放入明室立即開始實驗，暗室即可通電，記錄5min內錯誤次數(進入暗室的次數)，潛伏期(第一次從明室到暗室的時間)、暗室時間、明室時間、暗室路程等指標評價動物的避暗記憶再現能力。

（3）水迷宮實驗

3.1 水迷宮空間記憶

迷宮分為 4 個象限，將平臺置于其中一個象限中央，作為實驗中動物逃離水環境的唯一途徑， 空間記憶階段保持平臺位置固定不變。選擇其余 3 個象限作為動物的入水點將動物面向池壁放入水中，每天訓練 3 次，每次變換入水點位置( 使動物可分別從 3 個象限入水)，且每天所有動物入水點的順序保持一致。每次訓練前適應 10 s，使動物獲取并學習空間環境信息。設置檢測時間為 60s 后，將動物放入水中，若動物在 60 s 內找到平臺，算作尋臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留休息 10 s。若動物在 60 s內未找到平臺，結束此次訓練并記錄潛伏期為 60 s，并引導動物靠近平臺使其在平臺上停留 10 s。每只動物訓練的時間間隔為 40 min。每天每只動物 3 次訓練學習的潛伏期平均值，作為評價動物這一天學習能力的指標。經過 5d 的訓練學習后，第 6 天撤去平臺， 進行空間探索實驗。將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，檢測其在 60s 內在原平臺象限的游程比、時間比，以及穿過原平臺所在位置的次數，作為評價空間記憶能力的指標。

3.2 水迷宮工作記憶

空間探索實驗結束次日， 開始工作記憶實驗。工作記憶歷時 3d，分別將平臺置于其余 3 個不同象限中，每天變換平臺位置，同一天內平臺位置保持不變。每天訓練 3 次，依次從其余 3 個非平臺象限將動物面朝池壁放入水中。訓練前不予適應， 其余同空間訓練階段一致。計算 3 天中， 第 2 次訓練潛伏期的平均值，作為評價動物學習記憶能力的指標。