H7N9禽流感病毒感染小鼠模型

BALB/c為近交系小鼠，遺傳背景一致，微生物背景可控，個體間相似度高，易于操作；小鼠相關的免疫球蛋白、細胞類型、細胞因子等試劑己商品化，費用和飼養要求低。此外，H7N9病毒直接感染的BALB/c小鼠，感染模型主要表現為下呼吸道感染，重癥肺炎，肺部病理學損傷類似人感染后的嚴重病例，甚至導致小鼠死亡。所以BALB/c小鼠可作為研究流感病毒致病性、傳播力及傳播機制的主要動物模型之一。

1. 實驗環境

生物安全實驗室3級：參照2013年4月2日衛計委專家對新發甲型H7N9禽流感病毒生物安全評估會議指南暫定H7N9禽流感病毒屬于二類。將H7N9禽流感生物危害等級定位Ⅲ級。已被我國列為按甲類傳染病管理的乙類傳染病，對其病原體和動物感染實驗的操作應該在ABSL-3實驗室中進行。

獨立通風籠（IVC）

2. 實驗材料

1）毒株：H7N9毒株（A/Anhui/1/2013）；

2）實驗動物：SPF 雌性4-6周齡BALB/c小鼠；

3）試劑：DMED培養液，RNeasy Mini Kit（QIAGEN，74106）等

4）實驗儀器：

微型離心機（EASTWIN6000）

高速冷凍離心機(KUBOTA3500)

電動研磨器(德國IKA-T10)

倒置顯微鏡(Nikon)

實時熒光定量檢測系統（ABI）

二氧化碳培養箱（Thermo371）

生物安全柜

3. 實驗操作規程
1）動物分組：H7N9流感病毒感染20只4-6周齡BALB/c雌性小鼠，其中10只為臨床觀察組，另外10只用于檢測病毒的組織分布，為解剖組（5只于感染后3天安樂并解剖，5只于感染后5天安樂并解剖）。
2）病毒接種：動物適應后使用三溴乙醇以0.02mL/g比例進行肌肉注射麻醉。麻醉后每只小鼠滴鼻接種0.05mL病毒效價為10⁵TCID50/mL的病毒稀釋液。
3）臨床指標：對臨床觀察組（n=10）小鼠進行持續21天的觀察，感染后0-14天每天記錄體重和死亡率，觀察動物的一般狀況，包括眼、鼻、口、臉、耳、爪、四肢、肛門、尾、被毛、活動和精神狀況，體重下降率超過25%為人道終點實行安樂。
4）病毒的組織分布：解剖組小鼠（n=10）感染后3天和5天各解剖5只（n=5），取腦、氣管、肺、腎、眼拭子進行病毒滴度測定。
5）病毒分離：感染后第3、5天感染雪貂安樂處死，尸檢時取肺、氣管、肝、脾、腦、腸、心和腎組織，研磨處理后，接種MDCK細胞。每天觀察病變，持續觀察3d，用火雞紅細胞測定HA確認。HA方法具體為：將接種標本的MDCK上清液取出50uL，加入等體積火雞紅細胞，室溫反應30min，出現凝集反應，結果為陽性。
6）H7N9病毒RNA的檢測：感染后第3、5天感染雪貂安樂處死，尸檢時取肺、氣管、肝、脾、腦、腸、心和腎組織，研磨處理后，操作步驟：將100uL組織研磨液上清移入裂解液（Qiagen）中，放入buffer RLT（已加入1%巰基乙醇）350uL，4℃，13000rpm離心3min，將上清轉移至新1.5mL微量離心管中，提取組織研磨液核酸。使用RNA一步法試劑盒，通過熒光定量PCR儀直接測定病毒載量。
7）H7N9病毒抗體檢測：動物感染后不同時間點采血分離血清，-80℃下保存備用。血清H7N9病毒性抗體檢測（HI方法）具體操作步驟為：每孔加入1:10~1:1280稀釋的待檢血清，加入8HA的病毒，室溫孵育30min。此后檢測凝集結果，血清凝集的效價為該血清可中和的抗體的效價。
8）病理學研究：大體觀察，處死動物后，詳細觀察肺、心、脾、腎、肝、腦、腸以及淋巴結等組織的形態變化；病理切片準備，取處死動物的肺等組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規病理組織切片處理后，HE或免疫組織化學染色后，鏡檢觀察。